Le metodiche diagnostiche per questa infezione si sono costantemente evolute, se pur con alcuni limiti, dovuti alla sua difficile propagazione (non è coltivabile in vitro, ma è possibile mantenerlo in vita solo tramite passaggi nei testicoli del coniglio). Gli esami microbiologici possibili sono l'individuazione diretta del patogeno e le indagini sierologiche. La diagnosi microbiologica di sifilide si basa principalmente sull'utilizzo di test sierologici. Questi si dividono in due categorie: test non treponemici e test treponemici. Per una diagnosi corretta, è consigliato di associare entrambe i tipi di indagini, al fine di arrivare alla definizione di un quadro completo del paziente.
La VDRL è la (veneral desease research laboratori test) è un saggio di flocculazione che ricerca nel siero dei pazienti anticorpi anti cardiolipina.
Nella VDRL il serio dei pazienti viene cimentato con una preparazione commerciale contenente antigene cardiolipidico fissato su cristalli di colesterolo. In presenza di anticorpi nel siero del paziente si forma un reticolo che agglutina questi cristalli. Gli anticorpi inducono l’aggregazione dei cristalli in ammassi di varie dimensioni a seconda della grandezza di tali ammassi la positività è espressa secondo una scala da + a +++.
Questa reazione è eseguita su piastra e la letture viene fatta con microscopio a luce ordinaria.
In caso di positiva è necessario ripetere la reazione con diluizione del siero del paziente ½, ¼ … si ottiene così una reazione quantitativa. Il titolo anticorpale è espresso come il reciproco della massima diluizione in cui il test ha dato risposta positiva.
La VDRL diviene positiva mediamente a 8-10 giorni dalla comparsa del sifiloma e il titolo sale rapidamente fino a stabilizzarsi nella fase secondaria dove raggiunge il livello massimo (compreso tra 256 e 1024). Nella fase terziaria della sifilide la sua positività può invece apparire dubbia.
La cardiolipina è contenuta in tutti i treponemi patogeni ma anche nelle cellule di numerose specie animali e vegetali. La VDRL non è pertanto una reazione specifica delle treponematosi e la sua positività non indica esclusivamente la diagnosi di treponematosi. I limiti dei test non treponemici sono una sensibilità non elevata (70% circa) nella sifilide primaria precoce, nella sifilide latente e nella sifilide congenita tardiva, ed una mancanza di specificità in presenza di particolari condizioni quali: infezioni virali (epatiti, mononucleosi, HIV e malaria herpes virus), patologie neoplastiche, malattie autoimmuni (lupus eritematoso e artrite reumatoide), gravidanza, età avanzata. I risultati dei test non treponemici devono essere dunque sempre confermati da un test treponemico.
La TPHA (test treponemico) è il test di emoaglutinazione del treponema .Questa reazione dimostra nel siero anticorpi contro treponemi patogeni. La reazione è pertanto specifica di tutte le treponematosi. Per converso essa non riconosce glia anticorpi diretti contro vari tipi di treponemi. In questa reazione il siero dei paziento è cimentato su una preparazione di treponemi fissati su emazie di montone. In presenza di anticorpi si formano dei complessi le emazie sono agglutinate. La reazione, ha luogo su piastre per microtitolazione e il risultato è letto a occhio nudo dopo 4-5 ore. In assenza di anticorpi le emazia sedimenta sul fondo dei pozzetti con reazione che risulta negativa. Se sono presenti anticorpi specifici le emazie vanno incontro a agglutinazione e dispersione. A seconda dell’entità di quest’ultima il risultato è espresso simbolicamente secondo una scala da + a +++. La lettura può risultare quindi influenzata da fattori soggettivi del tecnico che eseguisce l’esame. Esiste anche una TPHA quantitativa che consiste nel quantificare il titolo degli anticorpi presenti. La TPHA diviene elevato per tutta la vita in assenza di trattamento, anche nel secondo e nel terzo stadio della sifilide. Anche dopo il trattamento la TPHA resta comunque positiva e si negativizza solo , e non sempre, nel caso in cui il trattamento si stato effettuato entro il primo anno dall’insorgenza del sifiloma.
L'FTA/ABS (fluorescent treponemal antibody absorbetiontest)ricerca nel siero dei pazienti anticorpi dei pazienti treponemi pallidi interi uccisi è pertanto una diagnosi specifica per tutte le treponematosi e non della sola sifilide. Il siero del paziente è cimentato con una sospensione di treponemi di ceppo Nichols uccisi e la razione è rilevata dall’aggiunta di siero contenente anticorpi anti immunoglobuline umane marcate con fluorescina. La lettura è effetuata per mezzo di un microscopio dotato di sorgente di luce ultravioletta. Il riscontro di treponemi fluorescenti indica la presenza di anticorpi specifici nel siero dei pazienti. La semplice FTA è considerata specifica a diluizioni pari o superiori a 1/100; per aumentare la sensibilità del test senza alterarne la specificità è stato introdotto FTA-absorption (FTA-Abs) facendo assorbire il siero del paziente su un substrato contenente un estratto di treponemi saprofiti di ceppo Reiter sconciati: questa procedura porta alla neutralizzazione degli anticorpi gruppo specifici (anti—spirochete) che parassitano la reazione. Questa reazione è considerata specifica a diluizioni pari o superiori a 1/25 ed è utile quando il titolo anticorpale è presumibilmente molto basso come all’esordio del sifiloma, diviene infatti positiva circa 5 giori dopo la comparsa del sifiloma ed è quindi il primo test a virare prima della TPHA e della VDRL.
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e' di più recente introduzione. Il saggio immunoenzimatico elisa che consente la ricerca di anticorpi IgM specifici utile nei casi in cui si debba accertare una lue congenita o comunque una fase recente di replicazione attiva dei treponemi. La tecnica ELISA consente il rilevamento del complesso antigene-anticorpo mediante Sul fondo di un pozzetto di una piastra viene adsorbito l’Ag e successivamente viene introdotto il serio del paziente (che presumibilmente contieni Ac specifici per quela antigene). Dopo incubazione per permettere la formazione dell'eventuale complesso antigene-anticorpo (giallo), la soluzione che contiene l'anticorpo libero viene rimossa.
Si fa una successiva Incubazione con anticorpo secondario per la rivelazione del complesso antigene-anticorpo primario si introduce infatti una soluzione contenente un anticorpo specifico per il frammento costante dell'anticorpo primario. L'anticorpo secondario formerà un complesso con l'anticorpo primario a sua volta associato all'antigene (specifico). L'anticorpo secondario è modificato e porta legato un enzima (tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina).
Si introduce poi un substrato sintetico tale per cui il prodotto della reazione con l'enzima coniugato all'anticorpo secondario è colorato ( tipicamente: giallo per la fosfatasi alcalina o rosso per la perossidasi). La presenza del complesso antigene-anticorpo primario viene rilevata attraverso lo sviluppo del colore. L'intensità del colore dipenderà (a parità di tempo di incubazione) dal numero di complessi presenti
